主要用途

基因甲基化特異性PCR擴增（MSP）試劑盒是一種旨在通過設計符合胞嘧啶轉化的特殊引物，對轉化基因組的CpG島區(qū)域進行PCR擴增，探測基因甲基化信息的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。可以被用于父母印記、X染色體研究、腫瘤抑制基因等表觀遺傳學研究。產品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，擴增效率顯著。

技術背景

在基因的啟動子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“"的區(qū)域，稱為“島"（ island）。在人類基因組內，存在有近3萬個島。這些島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構，更是DNA甲基化的位置。島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

轉化樣品：經(jīng)過亞硫酸鹽轉化的目標DNA分子

特異引物：用于甲基化基因擴增的引導DNA分子

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作：

1．針對一個樣本，每次移出15微升擴增液（Reagent A）到PCR管

2．加入1微升用戶自備的的轉化或野生型DNA樣品（總量100納克）

3．分別加入1微升用戶自備的甲基化特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）

4．再加入7微升補充液（Reagent B）（反應總量為25微升）

5．即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）

6．加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項10）

7．即刻進行熱啟動PCR反應：

注意事項

1．本產品為60次操作

2．操作時，須戴手套

3．建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染

4．轉化后的DNA樣本須保存在－20℃冰箱里，否則容易降解；同時盡快進行擴增等后續(xù)操作

5．一個特定基因的甲基化檢測通常包括轉化、PCR和直接測序三步。PCR用于篩選和定位，可以發(fā)現(xiàn)0.1%甲基化；測序是精確定位，是分析金標準

6．一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括三組PCR： 野生型（W）、轉化后甲基型（M）、轉化后非甲基型（U）

7．甲基化特異性PCR的引物設計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個位點；位點須在3端；PCR片段長度在80－250堿基；三組引物取自同一位點，通過長度變化獲得相同的Tm，并在電泳上有所區(qū)別。

8．直接測序的引物設計原則是：引物不能含有CPG位點；引物含有足夠多的C（不和G相連）；采用巢式引物

9．基因甲基化區(qū)域選擇原則：如果是一個檢測的基因，首先，選擇啟動子部位；第二，選擇足夠多的CPG位點；第三、 選擇200堿基以上區(qū)域，且GC超過50%

10．通過1.8%瓊脂糖凝膠或15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U"Primers將產生擴增產物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M"Primer能被擴增

11．組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U"和“M"同時呈現(xiàn)陽性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析

12．根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）

13．建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）

14．在-20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融